500万彩票

您的位置: 网站500万彩票 >> 技术文章 >> 采用试剂盒因子法体外培养NK细胞的方法

采用试剂盒因子法体外培养NK细胞的方法

发布日期: 2020-09-27
浏览人气: 74

NkXIBAOYOUCHENGZIRANSHASHANGXIBAO,SHIRENTINEIKANGAIHUOXINGMIANYIXIBAOZHIYI,TAZAIGUSUIZHONGFAYUCHENGSHUHOU,ZHUYAOCUNZAIYUWAIZHOUXUE、GANZANG、FUMOQIANGHETAIPANZHONG,ZAIYUDAOZHONGLIUBINGBIANXIBAOSHIJIUHUIBATAMENSHASI,TONGSHIYEHUICIJISHENTICHANSHENGKANGZHONGLIUDEMIANYIFANYING,SUOYIBEIYIXUEJIECHENGWEI“KANGAIDEDI1DAOFANGXIAN”。

500万彩票NKXIBAOZHUYAOFENBUYUWAIZHOUXUE,ZHANWAIZHOUXUELINBAXIBAOZONGSHUDE5-10%,WUXUKANGYUANTICHENGXIBAOZUOWEIZHONGJIETICHENGKANGYUAN,YEWUXUKANGTIBANGZHU,KEZHIJIEQINGCHUSHUAILAOXIBAO、BIANXINGXIBAO、AIXIBAOJIBINGDUGANRANXIBAODENG。

NKXIBAOSHUYUBAIXIBAODEYIZHONG,TASHIRENTIZHONGCHENGDEWEISHI,ZHUYAORENWUJIUSHIXIAOMIENEIXIEYIJINGBEIBINGDUGANRANDEXIBAO,CONGERBABINGDUXIAOMIEZAI“YAOLAN”ZHONG。LINGWAI,SHENTILIMIANDEZHONGLIUXIBAOYESHITAMENZHUISHADEDUIXIANG。

NKXIBAOZAIJITIMIANYIJIANSHIHEZAOQIKANGGANRANMIANYIGUOCHENGZHONGQIDAOFEICHANGZHONGYAODEZUOYONG,SHIYIZHONGYOUXIAO、ANQUANDEZHONGLIUSHENGWUMIANYIZHILIAOFANGFA,JUYOUGUANGKUODEYINGYONGQIANJING。

FENLIPEIYANGNKXIBAOYOUDUOZHONGFANGFA,YIXIASHICAIYONGMOUZHONGSHIJIHEDEYINZIFATIWAIPEIYANGFANGFALAIPEIYANGNKXIBAO:

ZHEIZHONGFANGFACAIYONGZITIWAIZHOUXUEXIBAOZHONGFENLIDEDAODEDANGEHEXIBAO,JINGTIWAICAOZUOSHINKXIBAOKUOZENGHUOHUA,TONGGUOJIHUOTI NEITEYIXINGMIANYIFANYINGDADAOSHAHUOZHONGLIUXIBAOMUDEDEYIZHONGTIXIBAOZHILIAOFANGFA。

1.NK细胞培养试剂盒包含:
①无血清培养基2瓶(l000mL/瓶):
②NK试剂A, 1支:
③NK试剂B, 1支:
④NK试剂C, 1支:
⑤NK试剂D, 1支:
⑥NK试剂E, 1支:
培养体系中需用到2支(100万IU/支)rH IL-2
2.原材料
1.采取外周血(可从脐血、骨髓等组织)
2.需的试剂耗材包括:
0.4%苔盼蓝溶液、生理盐水、人淋巴细胞分离液(建议选用GE)、175cm²培养瓶、GT-T610 (A)培养袋、15ral/50ml/250ml离心管、移液管、1毫升无菌注射器
3.NK细胞培养时间过程:
前一天:要提前处理好细胞活化瓶(NK试剂A)
第1天:进行外周血单个核细胞分离与诱导(NK试剂B)
第3天:NK细胞第1次补液,补液50ml(NK试剂C)
第5天:NK细胞第二次补液,补液175ml (NK试剂D)
第7天:NK细胞第三次补液,装袋并补液500ml (NK试剂E)
第9-10天:NK细胞第四次补液,分袋并补液750ml
第12天:NK细胞第五次补液.补液500ml
第13天:检菌
第14、15天:培养成功
(细胞培养成功时间视具体细胞生长情况而定,在保持培培养基ph和细胞活力正常的情况下也可以多培养一天)
4.具体操作步骤如下:
1.头一天一定要先处理细胞活化瓶。
2.将NK试剂A (4度保存)加入到含有12.5ml生理盐水的175cm²底面积细胞培养瓶中,充分的混匀 30秒-1分钟,使液体充分在瓶底分散,4度冰箱平放过夜
(NK试剂A需要和生理盐水充分混匀平铺在瓶底;次日取出后直接吸弃液体即可,无需清洗)
3.外周血单个核细胞分离与诱导(第1天)
4.以100ml外周血为例,如血量不同,也可按操作规程做相应调整。
5.将患者外周血,用移液讶吸取少许原血(约300 ul)划线或滴入平皿过行检菌。然后,正常室温下,进行离心。
6.将上层血浆转入离心,灭活,离心,取上清液备用。
7.使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后,小心加到Ficoll层上,使分层保持清晰。室温内进行离心。
8.吸取外周血单个核细胞(PBMC)层,尽量吸尽两液面交接处的细胞层.加生理盐水吹打混匀,离 心。相同方法冉次洗涤细胞。
9.弃去上清后,用无血清培养基重悬细胞,吸取少量细胞计数。
10.按照细胞密度为1-2*10^6个/ml(5 *10^6个/ml),用培养基清洗离心管,并入培养瓶内,并加入1支NK试剂B,患者灭活血浆1.25ml (5%)确保培养基终体积为25ml左右。剩余血浆4°C 密封保存备用。
    注:包被瓶取出时间为细胞加入前5分钟,其他时间需在4度放置备用。
    试剂A、B、C、D、E的取用.違议第1次吸取原液后.以适貴培养基冲洗西林瓶后再吸出,以大程度减少损耗

11.活化培养基的配置:其中1瓶无血清培养基中,加入100万IU的IL-2,终浓度为1000IU/mL。
      注:活化培养基每次使用前恢复至室温。
12.NK细胞的第1补液(第3天),补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂C,确保培养的终体积为 75mL。
13.NK细胞的第二次补液(第5天),补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂D,确保培养的终体积为 250ml.
14.NK细胞的第三次补液及其装袋(第7天),细胞转袋前将培养瓶底部的细胞进行轻微吹散细胞,随后将培养瓶的中的细胞悬液及其500mL活化培养基,装入到细胞培养袋中,同时加入1支NK试剂E,及其剩余的全部血浆,确保终体积为750ml。
15.NK细胞的第四次补液(第9天),主要为分袋操作,将培养体系由750ml扩增至1500ml。
16.NK细胞的第五次补液(第!2天).主要为补液操作,将剩余的500mL扩增液均分到2个培养袋中,确保每袋体积为1000ml。
17.检菌,细胞培养第13天,对细胞悬液进行检菌、内毒素检测。用5ml注射器分别从培养瓶和袋内抽取少最细胞悬液,加入正置的平皿中,放入35℃恒温生化培养箱, 记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置,保留48小时。
18.收获,正常情况下,第13, 14天各收获1000ml细胞悬液。若因临床需要进行提前或延迟回输,也可相应提前或延迟。(NK细胞建议2-4h之内使用,以保证其活性)

分享到:
500万彩票©2018 杭州仟诺生物科技有限公司 备案号:
  • SAOYISAO,GUANZHUWOMEN

500彩票
扫一扫访问手机站
访问手机站